目前遗传学已经确认，SMA主要与两个高度同源（是指这两个基因的序列非常相似）的基因密切相关，SMN1与SMN2，这两个基因主要通过7号外显子和8号外显子上的两个基因位点进行区分（下图来自Qu YJ et al, PMID: 27425821, J Mol Diagn,2016）。
一般来说，大部分正常个体都有2份拷贝的SMN1基因与2份拷贝的SMN2基因， SMN2基因发生外显子7的跳跃，只有少量的全长SMN mRNA，所以如果某个人两份拷贝的SMN1基因都失去功能的话一定会患病，只有一份SMN1基因起作用的个体为携带者。在SMN1基因都失去功能的情况下，SMN2基因拷贝数数目，则会影响患者的发病时间与疾病严重程度。根据Feldkötter et al. (Am J of Hum Genetics, 2002)描述，80%的I型SMA患者携带有1到2个SMN2拷贝，82%的II型SMA患者携带有3个SMN2拷贝，96%的III型SMA患者携带有3或4个SMN2拷贝。所以对于SMA患者来说，检测SMN2基因的拷贝数在一定程度上有助于评估疾病的严重性或预后。等等，你们已经发现以上内容有问题了，怎么会有4个SMN2拷贝呢？为了便于大家理解，上面提到大部分正常人的2份SMN2拷贝，由于基因所在区域的复杂性，实际上人群中SMN2拷贝数在0到4个。根据统计95%以上的SMA患者都会检测到SMN1基因外显子7和（或）外显子8纯合缺失，除此之外，还有复合杂合突变（一个等位基因缺失，另一个点突变）。
当你理解了以上内容后，还有一些比较复杂的情况，首先SMN1基因外显子7的那个独特碱基（c. 840C）可以由C转换为T，这样SMN1基因就变成了SMN2基因，从造成的结果上来说，这个转换与缺失的效果是一样的，但是对于患者来说就多了一个SMN2拷贝，其次，人群中有很低比例的正常人一条染色体上有2个SMN1拷贝，而另外一条染色体上为0个拷贝，这样的正常人SMN1基因型为2+0，其实也是携带者，但是目前没有切实可行的方法去区分1+1还是2+0，但是有一个位点与之高度关联，也许将来三代测序可以。当你了解了以上内容后，我们再来聊聊SMA基因检测，理想的基因检测应该达到如下效果：
1 明确区分患者、携带者、正常人；
2 如果为SMN1纯合缺失患者，能够检测SMN2拷贝数；
3 除了检测SMN1外显子7缺失或转换外，还能检测点突变；
4 可以识别SMN12+0基因型的特殊携带者；
SMA基因检测的方法有以下几类
PCR-RFLP或一代测序
首先对目标区域进行扩增，然后通过限制性内切酶或一代测序的方法来区分，如果是患者的样本，在c.840位点缺失SMN1的C峰，只显示SMN2的T纯合峰，正常人或携带者应该为杂合的C/T峰图，RFLP的分析方法性价比并不高，是那时唯一可以采用的新方法，替代SSCP分析。这个方法有个缺陷，就是有酶切不彻底的隐患，但是不能区分携带者与正常人，也不能检测SMN2拷贝数，在临床上可以诊断SMN1纯合缺失的患者，其他情况只能作为初筛。
双侧双重AS-PCR
该方法是由黄尚志老师带领团队开发，利用 SMN1与 SMN2基因中外显子7与内含子7的 2 处核苷酸差别, 分别设计 2个等位基因特异的引物，与内对照直接 在琼脂糖电泳及 PAGE进行分析, 获得很好的效果。 由于设计的引物正反向均有与 SMN1 基因特异碱基结合的位点 ,应用两个引物对模板的选择性, 增强了特异性。与酶切方法比较, 诊断结果完全一致, 但没有非特异扩增,避免了酶切不完全的缺点 ,且方法简便, 易操作,适宜临床使用。
荧光定量PCR
主要原理是通过两个多重实时荧光定量PCR反应，以单拷贝RPP40基因为内标基因，采用MGB-Taqman探针法分别对SMN1基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失或转换。
（图来自上海五色石医学研究股份有限公司官网）
优势是可以区分患者，携带者、正常人，其他如SMN1点突变和2+0基因型携带者也不能检测。患者的SMN2拷贝数需要另外设计探针进行检测。
MLPA
多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先报道，是早年几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，针对c.840C>T位点设计不同的探针序列，SMN1基因扩增子和SMN2基因扩增子可以扩增出不同的片段长度，而峰的高度可以反映拷贝数变异。
（图片来自Genetics in Med 2007:9(4)241-248）
MLPA技术除明确区分患者、携带者及正常人，同时检测患者的SMN2拷贝数，。目前临床上MLPA是SMA基因检测金标准，但是该试剂盒不能检测点突变与特殊的SMN1 2+0携带者。
PCR-DHPLC
DHPLC是一种基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。苏一宁等（pmid：15832310）通过针对c.840C>T位点设计特异性引物扩增SMN基因片段，结合峰高与内参基因来确定SMN1与SMN2拷贝数。
（图片来自苏一宁等，pmid：15832310）
PCR-DHPLC与MLPA类似可以明确区分患者、携带者及正常人，也可以检测患者的SMN2拷贝数。
二代测序
最近贝勒医学院的研究者在Genetics in Medicine杂志上发表了一项利用二代测序检测SMA的研究（pmid：28125085），该研究包括6648例样本。主要的原理是统计SMN1与SMN2总拷贝数，然后根据c.840C>T分析SMN1 reads与SMN2 reads比例，最后得出每个人分别携带几个拷贝的SMN1与SMN2。与MLPA相比，灵敏度大于98%，特异性大于98%。另外该研究还确诊了几个致病点突变位点，并且g.27134T>G与RFLP结果一致，该位点与SMN1 2+0型特殊携带者密切相关。但是对于SMN2拷贝数的灵敏度与特异性未明确描述，可能是因为该研究的目的主要是筛查，而非临床诊断。
(图片来自Feng Y et al，Genet Med. 2017)
临床上，很多肌肉疾病和SMA的表型容易混淆，难以鉴别，传统的MLPA等检测方法仅能定向检测SMA，而全外显子测序这类NGS技术不仅可以定向检出SMA，还可以同时覆盖其他相关表型的类似肌病，这是一个优势，当然NGS技术目前尚不能说是完美， NGS可以作为初筛诊断SMA和其他肌病的有效方法，但初筛疑似阳性的结果还需要进行MLPA或Sanger测序的验证。另外在SMN2拷贝数分析方面，NGS还有待更多的证据证明其准确性和可靠性。
最后
本文整理了SMA相关资料与各基因检测平台的比较，随着测序成本的下降，通过全外显子或大Panel进行遗传病筛查与诊断已经成为趋势，而对于大片段缺失重复的疾病如果能够通过算法优化检测将让NGS性价比更高，在临床上，对于SMA患者，还需要MLPA验证及确定SMN2拷贝数。
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日期：2017.03.24
